TÍTULO

PROTEÍNAS G EM TRYPANOSOMA CRUZI: DETECÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA

TIPO

Tese de Mestrado

AUTOR

Jaime Paba Martínez
e-mail: bucaros@unb.br

ORIENTADOR

Prof. Dr. Carlos A. O. Ricart
e-mail: ricart@unb.br

IDIOMA

Português

INSTITUIÇÀO QUE OTORGOU O TÍTULO

Dep. Biologia Celular

Lab. de Bioquímica

Universidade de Brasília

ENDEREÇO PARA CONTATO

Dep. Biologia Celular

Lab. de Bioquímica

Universidade de Brasília

70910-900 Brasilia, Brasil

PALAVRAS CHAVE

Trypanosoma, espectrometria de massa, transdução de sinais, proteína G.

AUXÍLIO FINANCEIRO

Conselho Nacional de Pesquisa CNPq (Brasil)

DATA DA DEFESA

Setembro de 1998

RESUMEN

Proteínas G foram detectadas especificamente em Trypanosoma cruzi através de "immunoblotting" utilizando-se soros específicos contra subunidades ( de proteínas G heterotriméricas de diferentes classes. Desse modo, uma proteína de 37 kDa, fortemente associada a fração de membrana, foi reconhecida pelo antisoro Gas enquanto três outras, presentes na fração solúvel do parasita foram reconhecidas respectivamente pelos antisoros Gao (36 kDa), Gai (45kDa) e Gacommon (48 kDa). Experimentos de marcação por afinidade usando GTP radiomarcado, detectaram polipeptídeos com massas similares aos detectados imunologicamente. A análise da expressão das subunidades G alfa nas três formas do parasita: epimastigotas (E), amastigotas (A) e tripomastigotas(T), mostrou níveis diferentes das proteinas Gao e Gas, de um estágio para outro. Os padrões encontrados foram de T>A>E, para Gao e de E>T>A para Gas, sugerindo um provável papel na diferenciação do parasita.

As proteínas Gai, Gas e Gacommon de epimastigotas foram purificadas através de cromatografia de troca iônica em FPLC e SDS-PAGE. As proteínas purificadas foram digeridas diretamente do gel com tripsina e os peptídeos resultantes foram submetidos à análise por espectrometria de massa tipo electrospray e à purificação por cromatografia de fase reversa-HPLC seguida de microsequenciamento automático. As análises do espectro de massa da proteína Gai e da sequencia aminoterminal de um dos seus peptideos, revelaram alta homologia com subunidades Ga de Dictyostelium discoideum e Saccharomyces cerevisiae respectivamente, demonstrando que a proteína purificada é uma subunidade Ga, provavelmente do tipo Gai. Por outro lado, a proteína reconhecida pelo soro Gacommon apresentou também homologia com subunidades Ga, embora não tão elevada como a proteína Gai.

Outros 4 polipeptideos foram isolados da fração soluvel do parasita por cromatografia de afinidade em GTP-agarose. Estes não foram reconhecidos por antisoros contra subunidades Ga e as sequências aminoterminais obtidas ainda não permitiram sua identificação.