TÍTULO
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DA CATEPSINA B DE TRYPANOSOMA CRUZI

TIPO: Dissertação de Mestrado

AUTOR: Gloria Ester Cadavid Restrepo gcadav@unb.br,gcadav@eudoramail.com

IDIOMA: Portugués

DIRECCIÓN PARA CONTACTO
Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas
Faculdade de Medicina
Universidade de Brasília
70900-010 Brasília D.F., Brasil

ORIENTADOR: Prof. Dr. Jaime Martins de Santana jsantana@unb.br

FECHA DE LA DEFENSA: 20 de julho de 2001

ENTIDADES QUE FINANCIARON LA INVESTIGACIÓN: CAPES

INSTITUCIÓN QUE OTORGÓ EL TÍTULO
Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular
Faculade de Medicina
Universidade de Brasília - UnB

PALABRAS CLAVE: Trypanosoma cruzi, Catepsina B, proteases

A catepsina B de T. cruzi foi obtida a partir de um extrato total de formas epimastigotas do estoque Tulahuen. A purificação foi realizada utilizando-se o protocolo descrito por Garcia et alii. (1998) com algumas modificações. Tais modificações em função de uma enzima de 41 kDa com forte atividade sobre o substrato GGR-AMC, que era sistematicamente co-purificada. Sua sequência N-terminal apresentou 100% de identidade com a cruzipaína. A atividade enzimática da catepsina B de T. cruzi foi testada sobre diferentes substratos fluorogênicos, com o objetivo de se conhecer sua preferência por sítios de clivagem. Neste estudo, foi observado que a enzima possui forte atividade hidrolítica sobre FR-AMC, RR-AMC e LLVY-AMC, apresentando apenas atividade moderada sobre LY-AMC e GR-MNA. Foi demostrado que esta protease não apresenta atividade sobre R-AMC e GGR-AMC, bem como sobre os substratos de aminopetidases IA-AMC, GP-AMC e L-AMC.

A protease purificada de T. cruzi mostrou-se capaz de degradar um espectro de proteínas não relacionadas, tais como BSA, fibrinogênio, IgG desnaturada e fibronectina, apesar da degradação desta última ter sido comparativamente menor que a das demais. A mesma atividade não foi observada sobre laminina e IgG nativa, em nossas condições. Estes resultados consolidam a noção de que a catepsina B possui ampla especificidade por substratos naturais.

Com relação aos resultados de caracterização cinética, foi determinado que o substrato sintético pelo qual a protease demonstra maior especificidade consiste no dipeptídeo FR-AMC, o que se traduz por uma eficiência catalítica da ordem de 1,4 e 2,2 vezes maior que aquelas calculadas para RR-AMC e LLVY-AMC, respectivamente.

Quanto aos parâmetros de inibição da catepsina B, foram utilizados inibidores reversíveis e irreversíveis. O mais potente dos inibidores foi E-64, o qual apresentou uma constante de associação maior que aquela apresentada por TLCK. A inibição com antipaína foi maior em relação à leupeptina. O perfil cinético dos inibidores reversíveis demostrou que antipaína apresenta um comportamento de inibição competitiva, enquanto que leupeptina apresenta um comportamento não competitivo. Esses dados demostraram que a catepsina B de T. cruzi apresenta tanto constantes cinéticas quanto de inibição semelhantes ao das catepsinas B já descritas.